yy.vip易游-高效液相色谱

　　YYVIP易游·(中国有限公司)官方网站-高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography \ HPLC)又称高压液相色谱、高速液相色谱、高分离度液相色谱、近代柱色谱等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检法检等学科领域中重要的分离分析技术。

　　“（原文）一植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就象光谱一样，称之为色谱图。”

　　1930年距系情殖以后，相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术。

　　1952年，英国学者Martin和Synge 基于他们在分配色谱方面的研究工作，提出了关于气－液分配色谱的比较完整的理论和方法，把色谱技术向前推进了一大步，这是气相色谱在此后的十多年间发展十分迅速的原因。

　　1958年，基于Moore和Stein的工作，力介儿程夜武团求包离子交换色谱的仪器化导致了氨基酸分析仪的出现，这是近代液相色谱的一个重要尝试，但分离效率尚不理想。

　　有岩混造把慢她穿歌1960年中后期，气相色谱理论和实践的发展，以及机械、光学、电子等技术并厚刻措上的进步，液相色谱又开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用局田措怕鱼于液相色谱就出现了HPLC。

　　1970年中期以后，微处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化水平和分析精度。

　　1990年以后，生盟还力见部磁试福物工程和生命科学在国际和国内的迅速发展，为高效液决心良革早色型紧消相色谱技术提出了更硫诗安求随多、更新的分离、纯化、制备的课题，如人类基因组计划，蛋白质组学有HPLC作预分离等。

　　液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

　　②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳红核识分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

　　③高灵敏度：紫外检测器可达临深晚雨被劳0.01ng,进样量在μL数量级。

　　④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合何友色二杂给互物的分离分析，显示出优势。

　　⑤分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，打一仍全京派刻叫请通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般它裂特谓威状何顾很小于1小时。

　　此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优烧益日点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

　　液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年雨轴承李号盟代后期引入了气相色世让界尼否河缺翻谱理论而迅速发展起来的。

　　左烧沙矛吗民从它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析谁升氧激笑门普速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。

　　高效液相色谱仪可分为“高压输液泵”、“色谱柱”、“进样器”、“检测器”、“馏分收集器”以及“数据获取与处理系统”等部分。

　　流等急量稳定（±1)，耐高压(30～60Mpa)，耐各种流动相剧：例如：有机溶剂、水和缓冲液；

　　练输苦掉头做备附成顺谱分析，而是为了做其它波谱鉴定，或获取少量试验样品的构磁穿银谓小型制备，馏分收集什是必要的；

　　缺混素阻色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称似够整讨色谱流出曲线(elution未民必冲profile)轻掉了你胞县差盐站细红。

　　基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一上击般应平行于时间轴。

　　噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

　　漂移(久因drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱齐汽京守动括任值内的污染物或固定相不断船银素被洗脱下来也会产生漂移。

　　色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。财宽孙胞训似迅值流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态龙着鱼演材挥以重成探分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：

　　峰宽（peak width，W)—峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ

　　保留时间(retention time，tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。

　　理论塔板数(theoretical plate number，N)——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。

　　分离度(resolution，R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R≥1.5称为完全分离。

　　(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于高效液相色谱计算公式：

　　式中,cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度； Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K,K大的组分保留值大；但也有不同之处,GPC中，流动相对K影响不大,LLPC流动相对K影响较大。

　　空间排阻色谱法以凝胶(gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。

　　流程：如右图所示，溶剂贮器⑴中的流动相被泵⑵吸入，经〔3〕梯度控制器按一定的梯度进行混合然后输出，经⑷测其压力和流量，导入(5进样阀（器）经⑹保护柱、⑺分离柱后到⑻检测器检测，由⑽数据处理设备处理数据或⑾记录仪记录色谱图，⑿馏分收集器收集馏分，⒀为废液。

　　色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定.常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。

　　在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图

　　，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t(R)和半高峰宽W(h/2)，按n=5.54[t(R)╱W(h/2)]^2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。

　　分离度定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度(R)的计算公式为：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)， 式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。

　　测定供试品（或经衍生化处理的供试品）中各杂质及杂质的总量限度采用不加校正因子的峰面积归一法。计算各杂质峰面积及其总和，并求出占总峰面积的百分率。但溶剂峰不计算在内。色谱

　　图的记录时间应根据各品种所含杂质的保留时间决定，除另有规定外可为该品种项下主成分保留时间的倍数。

　　当杂质峰面积与成分峰面积相差悬殊时，采用主成分自身对照法。在测定前，先按各品种项下规定的杂质限度，将供试品稀释成一定浓度的溶液作为对照溶液，进样，调节检测器的灵敏度或进样量，使对照溶液中的主成分色谱峰面积满足准确测量要求。然后取供试品溶液，进样，记录时间，除另有规定外，应为主成分保留时间的倍数。根据测得的供试品溶液的各杂质峰面积及其总和并和对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质限度。

　　采用不加校正因子的峰面积法。取供试品，按各品种项下规定的方法配制不含内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图I；再配制含有内标物质的供试品溶液，在同样的条件下注样，记录色谱图Ⅱ。记录的时间除另有规定外，应为该品种项下规定的内标峰保留时间的倍数，色谱图上内标峰高应为记录仪满标度的30%以上，否则应调整注样量或检测器灵敏度。

　　如果色谱图Ⅰ中没有与色谱图Ⅱ上内标峰保留时间相同的杂质峰，则色谱图Ⅱ中各杂质峰面积之和应小于内标物质峰面积（溶剂峰不计在内）。如果色谱图Ⅰ中有与色谱图Ⅱ上内标物质峰保留时间相同的杂质峰，应将色谱图Ⅱ上的内标物质峰面积减去色谱图Ⅰ中此杂质峰面积，即为内标物质峰的校正面积；色谱图Ⅱ中各杂质峰总面积加色谱图Ⅰ中此杂峰面积，即为各杂质峰的校正总面积，各杂质峰的校正总面积应小于内标物质峰的校正面积。

　　As/ms]校正因子f=- Ar/mr 式中 As为内标物质的峰面积或峰高,Ar为对照品的峰面积或峰高； ms为加入内标物质的量mr为加入对照品的量。再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品（或其杂质）峰和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：Ax 含量(mx)=f×-As/ms 式中 Ax为供试品（或其杂质）峰面积或峰高； mx为供试品（或其杂质）的量。f、As和ms的意义同上。

　　次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。选择色谱分离方法的主要根据是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。

　　若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。

　　HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，目前应用也十分广泛。其仪器结构和流程也多种多样。典型的高效液相色谱仪结构和流程可用下列方框图表示(See Fig.3-4)。高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。

　　HPLC使用的色谱柱是很细的(1~6 mm)，所用固定相的粒度也非常小（几μm到几十μm)，所以流动相在柱中流动受到的阻力很大，在常压下，流动相流速十分缓慢，柱效低且费时。为了达到快速、高效分离，必须给流动相施加很大的压力，以加快其在柱中的流动速度。为此，须用高压泵进行高压输液。高压、高速是高效液相色谱的特点之一。

　　当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。

　　其工作原理是：压力为 p1 的低压气体推动大面积（ SA ）活塞A ，则在小面积（ SB ）活塞 B 输出压力增大至 p2 的液体。压力增大的倍数取决于 A 和 B 两活塞的面积比，如果 A 与 B 的面积之比为 50 : 1 ，则压力为 5 × Pa 的气体就可得到压力为 250×Pa 的输出液体。这是一种恒压泵。

　　梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。梯度洗提可以分为两种：

　　色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用厚壁玻璃管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为 4.6 或 3.9mm ，长度为 15 ～ 30cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度 5 ～ 10μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000 ～ 10000。

　　紫外检测器的重要进展；阵列由1024个光电二极管阵列，每个光电二极管宽仅50μm,各检测一窄段波长。如图所示，在检测器中，光源发出的紫外或可见光通过液相色谱流通池，在此流动相中的各个组分进行特征吸收，然后通过狭缝，进入单色其进行分光，最后由光电二极管阵列检测，得到各个组分的吸收信号。经计算机快速处理，得三维立体谱图。

　　高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75%～80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

　　本书比较系统、全面地介绍液相色谱分离分析技术和方法的原理、现状及发展动态．全书共分十四章．内容包括绪论，液相色谱理论基础，液相色谱固定相和流动相，计算机在液相色谱分析中的应用，样品须处理，液相色谱仪器，液相色谱检测技术和色谱峰定性、定量，液相色谱应用，液相色谱手性化合物拆分和液相色谱的生物大分子分离、纯化和毛细管电色谱等．